胰蛋白酶的制備及活力的測定

實(shí)驗(yàn)原理

胰蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于動物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌浮?/p>

胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點(diǎn)約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300），其等電點(diǎn)約為pH10.8，zui適pH7.6～8.0，在pH=3時zui穩(wěn)定，低于此pH時，胰蛋白酶易變性，在pH>5時易自溶。Ca2+離子對胰蛋白酶有穩(wěn)定作用。

重金屬離子，有機(jī)磷化合物和反應(yīng)物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰臟、卵清和豆類植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑。zui近發(fā)現(xiàn)在一些植物的塊基（如土豆、白薯、芋頭等）中也存在有胰蛋白酶抑制劑。

胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎ユI> 酰胺鍵> 肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來測定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺（簡稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（簡稱BANA）測定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡稱BAEE）和對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡稱TAME）測定酯酶活力。本實(shí)驗(yàn)以BAEE為底物，用紫外吸收法測定胰蛋白酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測定方法而異。

從動物胰臟中提取胰蛋白酶時，一般是用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來，然后再根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原）沉淀析出。經(jīng)溶解后，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌福拥鞍酌负蛷椥缘鞍酌竿瑫r也被激活），被激活的酶溶液再以鹽析分級的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分。收集含胰蛋白酶的級分，并用結(jié)晶法進(jìn)一步分離純化。一般經(jīng)過2～3次結(jié)晶后，可獲得相當(dāng)純的胰蛋白酶，其比活力可達(dá)到8000～10000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。

如需制備更純的制劑，可用上述酶溶液通過親和層析方法純化。

試劑和器材

一、試劑

pH2.5乙酸酸化水；2.5mol/L H2SO4；5 mol/L NaOH；2 mol/L NaOH；2mol/L HCl；0.001M

HCl；硫酸銨；氯化鈣。

0.8 mol/L pH9.0硼酸緩沖液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計(jì)檢查校正。

0.4 mol/L pH9.0硼酸緩沖液（用0.8 mol/L稀釋1倍即可）；

0.2 mol/L pH8.0硼酸緩沖液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計(jì)校正。

0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 緩沖液：取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。

底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 緩沖液中加0.34毫克BAEE和2.22毫克的氯化鈣。

二、材料

新鮮或冰凍豬胰臟

三、儀器

食品加工機(jī)和高速分散器；研缽；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽濾瓶；紗布；恒溫水??；紫外分光光度計(jì)；秒表；pH試紙。

操作方法

一、豬胰蛋白酶制備

（一）豬胰蛋白酶原的提取

• 豬胰臟1.0Kg（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結(jié)締組織后，絞碎。
• 加入2倍體積預(yù)冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃攪拌提取24小時，四層紗

布過濾得乳白色濾液，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，放置3～4小時后用折迭濾紙過濾得黃色透明濾液（約1.5升）。

• 加入固體硫酸銨（予先研細(xì)），使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492克）放置過

夜后抽濾（擠壓干），得豬胰蛋白酶原粗制品。

（二）胰蛋白酶原激活

• 向胰蛋白酶原粗制品濾餅分次加入10倍體積（按餅重計(jì)）冷的蒸餾水，使濾餅溶

解，得胰蛋白酶原溶液。將研細(xì)的固體無水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中（濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一計(jì)），使Ca2+與SO42-結(jié)合后，邊加邊攪拌均勻，邊加邊攪拌，使溶液中zui終仍含有0.1M CaCl2。

2．用5M NaOH調(diào)pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg）輕輕攪拌，于室溫下活化8～10小時，（2～3小時取樣一次，并用0.001M HCl稀釋），測定酶活性增加的情況。

3．活化完成（比活約3500～4000BAEE單位）后，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，抽濾除去CaSO4沉淀。

（三）胰蛋白酶的分離

1．將已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入細(xì)粉狀固體硫酸銨，使溶液達(dá)到0.4飽和度，放置數(shù)小時后，抽濾，棄去濾餅。

2．濾液按250克/升加入研細(xì)的硫酸銨，使溶液飽度達(dá)到0.75，放置數(shù)小時，抽濾，棄去濾液。

（四）胰蛋白酶的結(jié)晶

1．將上述胰蛋白酶濾餅（粗胰蛋白酶）溶解后進(jìn)行結(jié)晶：按每克濾餅溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸緩沖液的量計(jì)加入緩沖液，小心攪拌溶解。

2．用2M NaOH調(diào)pH至8.0，注意要小心調(diào)節(jié)，偏酸不易結(jié)晶，偏堿易失活，存放于冰箱。3．放置數(shù)小時后，應(yīng)出現(xiàn)大量絮狀物，溶液逐漸變稠呈膠態(tài)，再加入總體積的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液，使膠態(tài)分散，必要時加入少許胰蛋白酶晶體。

4．放置2～5天可得到大量胰蛋白酶結(jié)晶，待結(jié)晶析出*時，抽濾，母液回收。

（五）胰蛋白酶的重結(jié)晶

將*次結(jié)晶的胰蛋白酶產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶：用約1倍的0.025M HCl，使上述結(jié)晶分散，加入約1.0～1.5倍體積的pH9.0 的0.8M硼酸緩沖液，至結(jié)晶酶全部溶解，取樣后，用2M NaOH調(diào)溶液pH至8.0（準(zhǔn)確）（體積過大，很難結(jié)晶），冰箱放置1～2天，可將大量結(jié)晶抽濾得第二次結(jié)晶產(chǎn)物（母液回收），冰凍干燥后得重結(jié)晶的豬胰蛋白酶。

二、胰蛋白酶活性的測定

以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文縮寫為BAEE）為底物，用紫外吸收法進(jìn)行測定。苯甲酰L—精氨酸乙酯在波長253nm下的紫外吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于苯甲酰L—精氨酸（英文縮寫為BA）。在胰蛋白酶的催化下，隨著酯鍵的水解，苯甲酰L—精氨酸逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外吸收宜隨之相應(yīng)增加。

取2個光程為1厘米的帶蓋石英比色杯，分別加入25℃予熱過的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點(diǎn)。再在另一比色杯中加入0.2ml待測酶液（用量一般為10微克結(jié)晶的胰蛋白酶），立即混勻并記時，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀3~4分鐘?？刂艱A253/min 在0.05 ~ 0.100左右為宜。

繪制酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線，從曲線上求出反應(yīng)起始點(diǎn)吸光度隨時間的變化率（即初速度）DA253/min。

胰蛋白酶活力單位的定義規(guī)定為：以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25℃，反應(yīng)體積3.0ml，光徑1厘米的條件下，測定DA253，每分鐘使DA253增加0.001，反應(yīng)液中所加入的酶量為一BAEE單位。

胰蛋白酶溶液的活力單位（BAEE單位/ mL）＝

胰蛋白酶比活力（BAEE單位 / mg ）＝

注意事項(xiàng) 

（1）胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

（2）在室溫14～20℃條件下8～12小時可激活*，激活時間過長，因酶本身自溶而會使比活降低，比活性達(dá)到“3000～4000BAEE單位/mg蛋白”時即可停止激活。

（3）要想獲得胰蛋白酶結(jié)晶，在進(jìn)行結(jié)晶時應(yīng)十分細(xì)心地按規(guī)定條件操作，切勿粗心大意，前幾步的分離純化效果愈好，則培養(yǎng)結(jié)晶也較容易，因此每一步操作都要嚴(yán)格。酶蛋白溶液過稀難形成結(jié)晶，過濃則易形成無定形沉淀析出，因此，必需恰到好處，一般來說待結(jié)晶的溶液開始時應(yīng)略呈微渾濁狀態(tài)。

（4）過酸或過堿都會影響結(jié)晶的形成及酶活力變化，必須嚴(yán)格控制PH。

（5）*次結(jié)晶時，3～5天后仍然無結(jié)晶，應(yīng)檢查pH，必要時調(diào)整pH或接種，促使結(jié)晶形成。重結(jié)晶時間要短些。